实验背景

CCK8（Cell Counting Kit-8）是一种广泛应用于细胞增殖和活性检测的试剂盒。其核心成分是WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2H-四唑单钠盐），该试剂在特定条件下能够被活细胞内的脱氢酶代谢为具有高度水溶性的橙黄色产物，从而通过颜色变化来反映细胞的数量和活性。

实验原理

CCK8试剂的工作机制基于细胞内代谢过程中的电子传递链。当细胞处于正常状态时，其线粒体中的脱氢酶会将WST-8转化为可溶性形式的橙黄色产物，这种产物的吸光度可以直接反映细胞数量或活性。而死细胞由于缺乏完整的代谢系统，无法参与这一转化过程，因此不会产生明显的信号。通过测定样品在450nm波长下的吸光度值，可以定量分析细胞的存活率或增殖能力。

实验步骤

1. 准备材料

- CCK8试剂

- 待测细胞悬液

- 96孔板或其他适合的培养容器

- 配套的移液器及枪头

- 超纯水或PBS缓冲液

2. 细胞接种

根据实验需求，将一定浓度的细胞悬液均匀分配到96孔板中，每孔加入适量细胞（通常为5000-10000个/孔）。确保每个样本至少设置三个重复孔以保证数据可靠性。

3. 孵育处理

将接种好的细胞置于适宜的培养条件（如37℃、5% CO₂）下孵育一段时间（一般为24小时），使其贴壁生长并适应环境。

4. 添加CCK8试剂

在孵育结束后，小心地向每孔中加入等体积的CCK8工作液（通常是10μL），轻轻晃动混匀，避免产生气泡。再次放回培养箱中继续孵育1-4小时。

5. 测量吸光度

使用酶标仪在450nm波长处读取各孔的吸光度值。如果需要校正背景干扰，可以同时记录600nm附近的参考吸光度值。

6. 数据分析

根据公式计算细胞存活率：

\[

细胞存活率 (\%) = \frac{A_{实验组}}{A_{对照组}} \times 100\%

\]

其中\( A_{实验组} \)为实验组的平均吸光度，\( A_{对照组} \)为对照组的平均吸光度。

注意事项

- 实验过程中应严格控制操作温度，避免过高或过低影响结果准确性。

- 确保所有器材均经过彻底清洗，防止污染影响实验结果。

- 如果样品中含有较高浓度的EDTA等金属螯合剂，则可能抑制WST-8的还原反应，需预先去除这些干扰物质。

通过以上方法，您可以高效准确地完成CCK8实验，获得可靠的细胞活性数据。希望本指南能帮助您顺利完成相关研究任务！